在生物医学研究中，磷酸化蛋白Western Blot（WB）常常成为实验室的“噩梦”，这主要归因于其低丰度、高动态以及易降解的特性。由于任何步骤的细微偏差都可能导致信号丢失或非特异性信号的放大，因此解决这一难题至关重要。今天，我们将深入分析磷酸化蛋白WB实验中的痛点，并提出相应的改进建议。

磷酸化蛋白WB实验痛点及解决方案

样本制备

1. 占比小：磷酸化蛋白通常仅占总蛋白总量的1%-10%，所需检测的信号接近WB检测的下限。
2. 动态范围窄：激酶或磷酸酶活性的变化会在几分钟内改变磷酸化水平，例如在EGF刺激后，EGFR磷酸化在5分钟内达到峰值，30分钟后降至基线，易错失真实信号。
3. 磷酸酶持续作用：细胞裂解后大量内源性蛋白磷酸酶的释放，会催化磷酸化蛋白的去磷酸化，显著降低磷酸化水平。
4. 温度敏感：在室温下，磷酸化蛋白的半衰期只有几分钟，例如在25℃下，MAPK磷酸化在10分钟内减少90%。

综上所述，成功进行磷酸化蛋白WB的关键在于样品的质量。因此，在样品制备过程中，全程应保持冰浴，确保低温操作；同时，在蛋白裂解液中适量加入磷酸酶和蛋白酶抑制剂，以防止蛋白降解或去磷酸化；为保障磷酸化活性，应使用新鲜蛋白样本，采用液氮速冻后在-80℃保存，避免反复冻融；电泳时确保充分的蛋白上样量。

抗体选择

1. 参考文献：查阅高分或相关文献，确认目标蛋白的磷酸化位点，选择经过验证的磷酸化抗体，以提高信号灵敏度（不同批次的抗体可能恢复各异，建议在同一实验中使用相同批次的抗体）。
2. 内参检测：总蛋白表达量可作为另一种内参，帮助区分磷酸化蛋白与总蛋白表达量之间的动态一致性。因此，除了常用的GAPDH或β-actin作为内参外，建议同步检测目标蛋白的总表达量，以获得更准确的结果。

PG电子提供多种高特异性、高灵敏度的磷酸化抗体，广泛应用于WB及IHC等实验中。对于有需求的客户，可以咨询我们的产品专员以获得更多信息。

电泳及转膜

1. 根据目标蛋白的大小选择合适的胶浓度，电泳全过程保持冰浴，以避免温度过高引起的磷酸化降解。
2. 为避免非特异性条带，选用适合的蛋白Marker以确认目标蛋白大小。
3. 使用新鲜配制的转膜液可以提高转膜效率。
4. PVDF膜相比NC膜更有效捕捉磷酸化蛋白，推荐用于磷酸化蛋白的转移。
5. 对于小分子磷酸化蛋白，可能出现转膜效率低的情况，建议适当缩短转膜时间或降低转膜电压。

封闭及抗体孵育

1. 封闭：建议使用5% BSA作为封闭液，其效果可能优于5%脱脂奶粉（因为某些脱脂奶粉中含有磷蛋白——酪蛋白，可能导致高背景及条带扩散）。封闭时间建议为1小时，并不宜过长。
2. 抗体孵育：根据抗体供应厂商提供的Protocol稀释抗体，或参考文献中的稀释比例及方法，可采用4℃过夜孵育一抗，以获得更好的结合效果。抗体孵育时间及浓度需根据实验结果进行优化。

每个步骤均可能影响最终结果，因此在进行磷酸化蛋白WB实验时，必须特别关注样本的磷酸化状态，并根据实际情况不断优化实验条件，以确保结果的准确性和重复性！

最后，PG电子为广大客户提供一系列特异性和灵敏度俱佳的磷酸化抗体，满足WB、IHC等多种应用需求。